大鼠三叉神经节神经元(TGN)原代细胞 分离培养和鉴定protocol 云克隆厂家protocol

大鼠三叉神经元原代细胞的分离

一、材料：

1、实验动物：1-3天的SD大鼠5只（雌雄不限）

2、组织来源：大鼠三叉神经节

3、手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）

4、消化酶：Ⅱ型胶原酶

5、培养基： DMEM/F12+10%FBS+1%双抗 +5ng/mlEGF+50nmol氢化可的松；①DMEM/F12（Gibco，Cat#: 51500056）；②EGF(Cloud-Clone，Cat#:APA560HU02）

③氢化可的松（aladdin，Cat#: H110523）

6、包被：0.1mg/ml的多聚赖氨酸

二、实验步骤

1. 培养瓶的包被：将浓度为0.1mg/ml的多聚赖氨酸加入6孔板中，以覆盖培养板底部为准，37℃培养箱内放置2h或4℃包被过夜，临用前用PBS清洗3次，于超净台中晾干备用。

2. 将大鼠置于75%酒精，浸泡5min。

3. 用手术剪沿枕骨大孔处逐层剥开颅骨、颞骨，，剪开硬脑膜，刮掉大脑小脑，暴露三叉神经，取出，置于预冷的含2%双抗的PBS中，再用2%双抗的PBS冲洗3次。

4. 用眼科剪沿剪碎，1-2mm³适量0.1% Ⅱ型胶原酶37℃消化，30min左右。

5. 消化期间每10min左右吹打一次，肉眼观察无明显组织后，不过滤，直接离心1200rpm 离心5min。

6. 去上清，加入完全培养基（DMEM/F12+10%FBS+1%双抗+5ng/mlEGF+50nmol氢化可的松）重悬，再将细胞接种于提前包被的培养瓶内。

7.3d后换液，细胞密度达到80%左右可以进行传代或冻存。

• 实验取材过程照片

图1：剪开硬脑膜，刮掉大脑小脑，暴露三叉神经图            图2：取出三叉神经

四、各阶段的神经元细胞照片（白光）

原代培养3天，可见少量贴壁神经元细胞 原代培养5天，细胞换液，神经元继续生长 原代培养7天以上，随时间增加，突起变长并交错呈网络，细胞扩增传代

 图1铺板后第3d （100X）                                      

图2铺板后第3d （200X）

• 大鼠三叉神经元的鉴定

常用鉴定方法：NeuN、MAP2和 β-tubulinIII特异性抗体的免疫荧光鉴定

以下图为β-tubulinIII特异性抗体的免疫荧光鉴定

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