智能纳米探针可视化肿瘤微环境

用于可视化肿瘤微环境的“智能”纳米探针

可激活分子成像纳米探针

引言

恶性肿瘤的预后因素，如生长、侵袭和转移，与生理参数变化密切相关，包括缺氧、[1]低细胞外pH、[2–4]酶、[5–7]还原性环境等。[8]例如，缺氧被认为是实体瘤微环境中的常见特征，与细胞行为改变、细胞外基质重塑以及转移行为增强相关。[9–11]由于高有氧糖酵解产生的乳酸导致的细胞外pH降低也被视为癌症的一个标志，[12]其可诱导细胞凋亡，通过影响血管内皮生长因子的浓度促进血管生成，并增强侵袭能力。影响酶的活性。[4,13,14]因此，检测肿瘤微环境中参数并阐明它们之间的关系，对于诊断肿瘤、预测侵袭潜力、评估治疗效果、制定治疗方案以及癌症预后具有重要意义。

肿瘤相关微环境因素通常通过识别特定肿瘤细胞中的特征性蛋白质以及肿瘤与正常组织之间的基因表达差异，在体外从分子水平进行分析。然而，体外表征无法揭示这些肿瘤相关参数的空间异质性及其随时间演变。因此，分析这些生理参数的体内方法正变得至关重要。

大多数已报道的关于肿瘤微环境的体内研究都是通过侵入性方法进行的。例如，为了检测肿瘤内的氧气或pH值[17–22]，需将微电极插入可触及的肿瘤中，如宫颈、前列腺、头颈部等。尽管这些方法具有较高的准确性，但由于每次只能获取一个位置的单一数值，因此无法提供整个肿瘤区域的信息。

与侵袭性方法相比，借助精密成像探针的非侵入性分子成像可提供细胞甚至分子水平生物过程的时空信息。[23–29]这些探针被设计用于靶向特定细胞或蛋白质，并产生可被接收和分析的信号。肿瘤相关微环境的生理参数是重要的标志物，使其成为设计生物响应“智能”纳米探针时的理想靶标。[30]因此，基于新型化学方法的精心设计对于构建超灵敏靶向触发探针，以实现体内非侵入性分子成像的成功具有重要意义。

一系列分子成像探针已经出现，包括小分子探针、[31]生物分子探针、[32]基于纳米颗粒（NP）的探针、[33–38]等。纳米颗粒（NP）为开发新型探针提供了理想平台，特别是在肿瘤微环境成像方面。[39]由于新形成的渗漏血管和较差的淋巴引流，尺寸规则的纳米颗粒（NP）倾向于在肿瘤区域积聚，而非正常组织，这一现象被称为增强渗透和滞留（EPR）效应。[40,41]此外，纳米颗粒（NP）为负载肿瘤靶向分子（如肿瘤特异性单克隆抗体）以及设计可激活的“智能”探针提供了理想平台。

可响应肿瘤微环境中刺激并通过新型表面工程设计的探针。这些“智能”纳米探针可被设计为在目标区域灵敏地产生信号，并提供肿瘤微环境中的生理参数信息，有助于对活体器官的解剖结构进行高分辨率成像以及对特定生物标志物进行实时定量检测。因此，响应性分子成像纳米探针在体内直接研究生物过程和分析疾病方面展现出无限前景。[42,43]本综述将总结可激活光学成像纳米探针、磁共振（MR）成像纳米探针以及光声（PA）成像纳米探针的制备策略、响应机制及生物应用（图1）。

光学成像是通过检测来自目标区域中荧光或发光探针的光子来生成图像的一种方法。在可激活分子成像纳米探针中，由于该成像方式具有实时反馈特性、光学材料在不同刺激下响应迅速，以及某些纳米颗粒（如金纳米颗粒、[44]氧化铁纳米颗粒[45]等）优异的猝灭能力，光学成像纳米探针似乎最受研究人员关注。荧光成像是最有潜力的光学成像之一。在荧光纳米探针被激发后，信号可通过肉眼、相机系统或更高分辨率的光学显微镜直接观察。[46–48]此外，稀土上转换发光纳米颗粒（UCNPs）所具有的大的反斯托克斯上转换发光（UCL）过程能够避免对生物体的光损伤，降低背景自发荧光，并显著提高激发光的组织穿透深度。这些优异特性使UCNPs成为设计可激活光学成像纳米探针的理想平台。[35,49–56]

磁共振成像是一种常用于临床肿瘤诊断的成像技术，其基于水质子自旋弛豫信号进行成像。由于具有细胞甚至亚细胞级空间分辨率，它已被证明是解剖结构成像的有力工具。然而，由于不理想的灵敏度，增强恶性肿瘤与正常组织之间的对比度仍然是一个巨大挑战。近年来，已设计出多种纳米探针，特别是可激活磁共振成像（MRI）纳米探针，以提高灵敏度。因此，本综述涵盖了这一内容。

光声成像是一种新兴的成像方式，依赖于光声效应。该成像方式结合了光学和超声成像技术，在体内表现出更好的组织穿透能力和更高的空间分辨率。已有一系列响应性光声成像探针被报道，用于在pH或酶刺激下检测肿瘤微环境。因此，我们也总结了智能光声成像纳米探针的发展。

2. 可激活光学成像纳米探针

为了设计成功的可激活光学成像探针，需要详细阐述材料的光学性质以及所采用的可激活原理。在各种最近报道的设计中，无论如何，绝大多数响应性光学成像探针可归结为“开启”型。“开启”型，换句话说即“关‐开”型，意味着响应性探针中的信号被淬灭，可在特定条件下被激活进入荧光状态。除了由单一刺激激活的纳米探针外，新型多响应型光学成像纳米探针也已被先驱者及我们课题组所报道。因此，这些类型的本部分总结了响应性光学纳米探针，每个章节中均包含了针对不同刺激的可激活纳米探针。

2.1. 单刺激响应型“开启”式纳米探针

为了靶向单一的肿瘤相关微环境生物标志物，理想的“关‐开”型响应性光学探针应在血液或正常组织微环境中几乎不发射荧光，而在肿瘤微环境中高度发光。设计可激活光学成像纳米探针有多种淬灭机制，包括荧光共振能量转移（FRET）、光致电子转移（PeT）、电荷转移和H‐二聚体形成。FRET效应描述了能量从供体向受体转移的机制，是可激活荧光探针中最广泛使用的机制，并且几乎适用于所有刺激类型。此外，比率型响应性光学探针也将在后续章节中讨论。

2.1.1. 氧气敏感型纳米探针

随着肿瘤的生长，快速增殖的癌细胞对氧气（O2）的需求将远远超过肿瘤血管系统所能提供的供氧能力，导致瘤内区域显著缺乏氧气低于健康组织的氧浓度。因此，缺氧是肿瘤微环境的常见特征。[74–76]在缺氧成像方面，由于硝基芳香族化合物、偶氮苯衍生物、多吡啶类和芘基单元在缺氧条件下具有较高的敏感转化性，被广泛应用于设计响应性探针。例如，偶氮苯在缺氧环境中会降解，常被用作生物还原连接子，用于响应性缺氧成像，并已有报道将其用于靶向小干扰核糖核酸（siRNA）递送。[77]为了提高活体成像的灵敏度和特异性，考虑采用氧敏感基团而非缺氧响应基团来构建智能纳米探针，如过渡金属配合物。[78,79]

郑等人通过开发一种氧敏感的近红外光学成像探针，于2015年实现了对肿瘤甚至微量肿瘤细胞的超灵敏检测。[79]该复合探针的关键功能组分是含有大共轭配体的铱（III）配合物（Ir–聚(N‐乙烯基吡咯烷酮)(PVP)）。该配合物在正常组织中可被O2淬灭，而在由于氧气浓度较低的肿瘤微环境中则可在近红外（NIR）区域发光。710纳米处的磷光发射使该探针具备深层组织成像所需的光穿透能力。他们基于相同的O2‐敏感发色团开发了纳米探针。[80]该纳米探针是由Ir–PVP与聚(ε‐己内酯)‐b‐聚(N‐乙烯基吡咯烷酮)(PCL–PVP)制备而成的胶束。由于O2‐敏感发色团和PCL链段具有疏水性，它们形成胶束的核心，而PVP链段因其亲水性和生物相容性构成外壳。该激活的纳米探针在多种动物模型中的性能得到了评估。结果表明，注射后48小时，该缺氧激活的光学成像纳米探针在转移性肺组织中的磷光信号强度比正常组织高出60倍。此外，注射后1小时，在具有转移的鼠的淋巴结中检测到的信号强度也比正常小鼠高出30倍。

半导体纳米晶体也已被报道用于设计具有优异光学性质的量子点（QD）‐染料氧气传感器。基于氧气指示剂与量子点之间的比率测量法，Amelia等人报道了一种具有高动态范围的氧响应型发光纳米传感器。通过化学吸附，将对O2敏感的发色团芘基单元修饰在CdSe@ZnS量子点的表面。在有氧条件下，量子点的发射相当稳定，而芘基单元则被O2强烈淬灭。因此，这两种发射之间的比率响应可用于测量O2压力。尽管这些量子点具有强疏水性，需要进一步修饰才能用于体内传感，但该探针功能可测量从0到1.013 bar O2的动态范围。

在活体成像中，由于掺杂镧系元素的上转换纳米颗粒（UCNPs）具有与f电子相关的独特上转换光学性质，因而受到广泛关注，并被用作构建可激活探针的平台。刘等人[83]通过将[Ru(dpp)3]2+Cl2,氧气指示剂封装到UCNP@中空介孔SiO2(mSiO2)的空腔中，制备了一种对O2敏感的纳米探针（图2）。

纳米探针结构及O2敏感发光机制示意图)

[Ru(dpp)3]2+Cl2在613 nm处的发光会在氧气存在下被猝灭。在980 nm激发下，发生上转换发光。NaYF4:Yb,Tm@NaYF4 UCNPs在450和475纳米处的发射可激发[Ru(dpp)3]2+Cl2，并形成发光共振能量转移系统。通过共聚焦激光扫描显微镜，在斑马鱼胚胎大脑中多次观察到纳米探针的可逆发光淬灭和恢复，且该过程依赖于O2浓度。结果表明，基于上转换纳米颗粒平台和氧气指示剂的纳米探针可成为实现活体缺氧检测的有力工具。

2.1.2. pH敏感型纳米探针

由显著增强的有氧糖酵解引起的酸性细胞外液是实体瘤的普遍现象，也是癌症的关键标志。正常组织的细胞外pH（pHe）保持在7.2–7.4范围内恒定不变。然而，在大多数肿瘤中，pHe通常低于正常组织，范围在6.2–6.9之间。因此，设计pH敏感型纳米探针在监测肿瘤及肿瘤微环境方面具有广阔前景。目前已制备出大量pH敏感型光学探针。典型的pH敏感机制包括可电离基团的质子化、酸可裂解键的降解等。

pH变化可诱导某些基团的电荷变化，进而引起构象转变。基于这种响应机制，Chiu等人报道了一种由聚电解质N‐棕榈酰化壳聚糖（NPCS）组成的pH敏感型纳米探针[84]。将带有供体（Cy3）或受体（Cy5）基团的NPCS首先在水溶液中充分混合，并在pH 4.0时形成纳米级网络簇。在酸性条件下，质子化胺基之间的电荷排斥导致NPCS链在纳米尺度网络中伸展。在此状态下，供体（Cy3）与受体（Cy5）之间的距离处于荧光共振能量转移（FRET）的有效范围内，从而发生能量转移。相反，在较高pH条件下，胺基发生去质子化，NPCS的疏水性增强，导致Cy3与Cy5基团之间的距离过远而无法实现能量转移。因此，通过构象转变诱导的pH敏感型FRET系统成功地映射了生物微环境中空间pH的变化。

pH变化也可诱导pH敏感材料的降解。基于该机制，已构建出依赖于在低pH下可溶解聚集体中荧光团之间能量转移的pH可激活纳米探针。李等人设计了一种基于自组装聚(l‐赖氨酸)（PLL）与葡聚糖偶联体系中IR783分子内能量转移的pH敏感型近红外纳米探针。通过pH不稳定的腙键标记在聚合物上的自猝灭近红外荧光团IR783，在正常组织中由于非辐射衰减而保持“关闭”状态；而在酸性肿瘤微环境中，荧光团从纳米探针上发生裂解，导致荧光将恢复。活体成像结果表明，在注射纳米探针24小时后，IR783在酸性肿瘤微环境中的近红外荧光增强了4.3倍，为pH激活的近红外纳米探针用于无创可视化活体肿瘤提供了设计策略。

同样，周等人设计了一系列可调节的pH可激活胶束纳米颗粒（pHAMs），采用可电离嵌段共聚物的设计方法。他们首先合成了含有可电离叔胺嵌段（PR）和聚环氧乙烷（PEO）片段的共聚物（PEO‐b‐PR）。[86]在高pH条件下，中和态的PR嵌段因疏水性增强而自组装形成胶束，通过荧光共振能量转移（FRET）和佩特（PeT）机制导致荧光淬灭。在低pH环境中，由于PR嵌段发生质子化，胶束解组装，荧光团发出强烈荧光。通过调节铵根基团的pKa值和PR疏水性，可实现不同的pH转变。这些超pH敏感（UPS）纳米探针具有快速的时间响应（<5 ms）、陡峭的pH转变（< 0.25 pH单位）以及开/关状态间高达55倍的高发射强度比率。基于先前精细调控PR嵌段疏水性的策略，该研究团队进一步将UPS设计扩展为一个包含操作者预设的pH转变的探针库，覆盖整个生理pH范围（4–7.4）以及宽范围的荧光发射（400–820 nm）。[87]该探针库中包含10种分别带有不同荧光团的纳米探针，每种间隔0.3 pH递增，且每个纳米探针均对环境pH保持极高的敏感性。库中的不同纳米探针可用于检测溶酶体pH、监测酸性肿瘤微环境pH、研究内体成熟过程等。例如，2014年，研究人员合成了具有在pH 6.9处的陡峭转变的胞外超pH敏感（UPSe）纳米探针，并在多种小鼠癌症模型中实现了活体肿瘤成像。UPSe纳米探针作为自组装胶束在血液pH下保持稳定并维持沉默的荧光信号，但在酸性A549肿瘤微环境中被激活后，其荧光强度显著增强，并表现出大的器官与血液比值（OBR，355）。该方法进一步在10种不同的肿瘤模型中实现了对肿瘤组织的pH敏感性检测，表明这似乎是一种通用策略。

2.1.3. 酶敏感纳米探针

酶敏感纳米探针的典型设计基于某些可被靶向酶切割的底物连接子。酯键水解是设计用于靶向肿瘤相关酯酶（包括磷酸酶、细胞内酸性水解酶等）的探针的常用机制。尽管在生理环境的化学条件下，酰胺键比酯键更稳定，但已被特定酶易切割的肽序列已应用于设计可激活探针，用于水解蛋白酶检测，如成纤维细胞激活蛋白α。偶氮结构在还原条件下易于断裂，因此含有芳香族偶氮连接子的探针可被偶氮还原酶激活，用于肝癌成像。

韦斯莱德及其同事首次报道了一种用于体内成像肿瘤并定量肿瘤细胞中蛋白酶活性的方法。[89]采用组织蛋白酶B敏感肽作为连接子，将近红外荧光（NIRF）染料Cy5.5与交联铁氧化物（CLIO）偶联。类似地，使用由蛋白水解抗性l‐精氨酰残基组成的连接子将染料Cy3.5偶联到CLIO上。由于连接子被切割，Cy5.5荧光会增强，而Cy3.5荧光保持不变。换句话说，Cy5.5荧光提供酶活性信息，Cy3.5荧光反映纳米探针的浓度。在混合这两种偶联物后，Cy5.5与Cy3.5之间的比率可以定量监测体内的酶活性，且不受纳米探针数量的影响。该研究证明，通过智能表面工程将荧光团与淬灭剂连接是体内成像特定酶的一种成功策略。

基质金属蛋白酶（MMPs）是一类蛋白水解酶，可调控多种肿瘤细胞行为，包括增殖、凋亡、侵袭和转移。因此，肿瘤微环境中MMPs的过表达可作为特异性位点生物标志物，用于设计酶敏感型成像纳米探针。将染料和淬灭剂通过MMP可切割肽连接是构建开启型探针的广泛应用的方法。林等人选择了 一对能量对Cy5.5和黑洞淬灭剂（BHQ，一种广泛使用的Cy5.5淬灭剂）来构建MMP敏感型纳米探针。首先将Cy5.5标记到肽序列（Cy5.5‐Gly‐Pro‐Leu‐Gly‐Val‐Arg‐Gly‐Cys）上，该序列可被多种类型的MMPs。随后，将染料和淬灭剂分别与铁蛋白偶联。最后，在中性pH条件下，标记了Cy5.5和淬灭7的铁蛋白会聚集形成组装体。在异种移植瘤上的活体成像表明，由于脯氨酸‐亮氨酸‐甘氨酸‐缬氨酸‐精氨酸（PLGVR）底物被切割并释放出Cy5.5，这些纳米探针在暴露于富含MMP的微环境后可立即被激活。

生物相容性金纳米颗粒（AuNPs）由于其优异的近红外荧光淬灭特性，常被用作可激活成像探针中的高效淬灭剂。李等人描述了一种蛋白酶敏感的近红外荧光淬灭探针，如图3所示。[93] AuNPs（20 nm）与Cy5.5通过一种针对MMP的特异性底物肽——甘氨酸‐脯氨酸‐亮氨酸‐甘氨酸‐缬氨酸‐精氨酸‐甘氨酸‐半胱氨酸连接。这种典型的基于AuNP的酶敏感型纳米探针的淬灭近红外荧光信号在肿瘤微环境中会恢复。该探针在动物模型中进行了评估，实现了对MMP活性的可视化检测。此外，通过更换特异性底物连接子，该策略还可应用于肿瘤微环境中其他多种蛋白酶。

酶触发纳米探针示意图)

半胱天冬酶是一类与细胞死亡相关的蛋白酶，是成像肿瘤凋亡的理想生物标志物。设计对半胱天冬酶敏感的纳米探针以用于监测肿瘤微环境中的凋亡将对评估治疗效果和抗癌药物递送具有重要意义。叶等人设计了一种对Caspase‐3/7敏感的纳米聚集荧光探针（C‐SNAF），具有近红外荧光光谱，如图4所示。[94]在治疗响应性肿瘤微环境中，升高的Caspase‐3/7会切割l‐Asp‐Glu‐Val‐Asp肽，导致探针疏水性增强并发生聚集。由于这些纳米聚集体倾向于滞留在凋亡微环境中，因此可通过比较肿瘤区域的荧光强度，在体内评估肿瘤对治疗的响应情况。

caspase‐3/7敏感纳米探针的结构示意图及环化反应机制)

2.1.4. 氧化还原敏感型纳米探针

氧化还原条件对人类的各种生物化学过程至关重要。例如，含硫醇的生物分子，如半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH），是动物细胞中重要的抗氧化剂。研究表明，肿瘤组织中的还原型谷胱甘肽浓度远高于健康组织。此外，活性氧（ROS）如过氧化氢（H2O2），是在大多数类型的实体瘤中也发现高水平的肿瘤相关氧化还原物质。因此，肿瘤相关的氧化还原物质也是设计响应性探针的替代靶点。

基于含有二硫键的连接子二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)（DSP），该二硫键可在还原条件下断裂，Niko等人开发了一种氧化还原敏感型荧光成像探针，其中荧光染料NR12D分子因疏水相互作用聚集形成胶束，其荧光被淬灭。[95]响应性连接子通过与NR12D的氨基偶联聚合到胶束上。在细胞内还原环境中，该探针的荧光可显著增强，因为DSP连接子会被降解，NR12D胶束将被释放并融合进入膜。基于有机发色团IR1061，其近红外吸收可被芬顿催化Fe2+存在下由H2O2生成的•OH所改变，Liu及其同事利用第二近红外窗口上转换纳米粒子开发了一种H2O2敏感的荧光成像探针。[96] NaErF4: Ho@NaYF4纳米颗粒在1530 nm激发下显示出980和1180 nm的上转换发射峰。结合IR1061，该染料可有效淬灭荧光在无H2O2,的情况下，该荧光成像探针可通过比率荧光（I980/I1180）揭示H2O2的浓度。

2.2. 多响应型纳米探针

上述探针通常仅对单一生物条件响应，但肿瘤的发生发展往往是多种生物因素共同作用的结果。同时，肿瘤微环境中这些生理参数之间存在高度相关性。因此，近年来发展了依赖多生物标志物的策略。考虑到某些酸性物质可能引起非特异性组织激活并导致假阳性，赵等人报道了一种基质金属蛋白酶（MMPs）/pH双刺激协同且可逆激活的多功能纳米探针，用于体内肿瘤特异性成像。他们采用金纳米棒（AuNRs）作为高效淬灭剂，并结合一种pH激活近红外不对称花青染料构建该探针。由于其可逆的pH响应性近红外吸收和荧光特性，不对称花青可用作肿瘤特异性成像探针。同时，使用MMP敏感的肽序列（H2NGPLGVRGCSH）作为连接子将AuNRs与不对称花青偶联。该探针仅在酸性微环境中被MMP‐13激活而发光，从而实现肿瘤特异性成像，避免“假阳性”结果。

为了揭示肿瘤相关因素之间的关联，侯等人提出了一种蛋白酶激活的pH敏感比率探针光学成像纳米探针。[45]一种MMP‐9敏感肽作为连接子，将比率荧光染料——3‐氨基‐1,2,4‐三唑并1,8‐萘酰亚胺的N‐羧基己基衍生物（ANNA）——偶联到Fe3O4纳米晶体上，如图5所示。

荧光纳米探针及其对基质金属蛋白酶‐9响应的示意图)

Fe3O4纳米颗粒是该比率荧光染料的理想淬灭剂。当该肽在富含MMP的微环境中被切割后，染料的荧光将恢复，即进入“开启状态”。这一策略使该纳米探针与以往的敏感型纳米探针显著不同。MMP‐9响应性降低了非特异性背景，而比率荧光可减轻荧光团浓度和组织深度对荧光强度的负面影响，并实现定量测定。[104]肿瘤区域pH值的活体成像表明，这种蛋白酶激活型pH敏感设计在微环境pH分析中具有可行性。

基于此，马等人通过添加近红外荧光染料Cy5.5作为内标（图6）进一步扩展了该概念。该内标稳定的发射信号与基质金属蛋白酶‐9激活的pH敏感比率染料（ANNA）的荧光可构成另一个比率荧光系统，用于定量绘制肿瘤微环境中MMP‐9活性的分布。活体成像实验表明，分子量低于单克隆抗体的叶酸（FA）使当前纳米探针更适用于全身递送，且MMP‐9活性在空间上与pH密切相关。为了深入理解pH与MMP‐9之间的关系，通过瘤内注射磷酸盐缓冲液调节肿瘤微环境pH。

纳米探针在体内的行为及其对酶的响应示意图)

盐水（PBS）缓冲液（20×）在不同pH条件下的结果表明，MMP‐9活性的异常与体内异常低pH在时间上具有良好的相关性。通过连续4天对肿瘤微环境进行成像，蛋白酶活性成像和pH成像结果显示，这两个区域可以预测肿瘤侵袭方向。双比率荧光探针设计的概念实现了对多个微环境生物标志物的同步定量监测，可能为更好地理解体内肿瘤进展提供一种强大的无创工具。

单刺激响应探针为肿瘤微环境的可视化提供了具有高信噪比的选择性和敏感性策略。与单刺激响应探针相比，多刺激响应探针不仅能提供更精确的特异性成像，避免“假阳性”结果的可能性，而且多参数的独立成像使研究人员能够深入理解这些因素之间及其与肿瘤发展之间的关系。

3. 可激活MRI纳米探针

类似于光学成像纳米探针，可激活MRI纳米探针也被设计出来。[105]设计可激活MRI纳米探针有几种概念：由肿瘤相关生理参数触发的顺磁性离子释放，精确控制粒子与周围质子的接触以及磁性纳米粒子的聚集。在本部分中，对这些磁共振成像纳米探针进行了总结。

3.1. 释磁性离子的磁共振纳米探针

在癌症区域释放顺磁性离子是增强纳米尺度造影剂T1‐MRI效果的最常用方法。[106–109]在这些阳离子中，由于钆（Gd3+）、锰（Mn2+）和铁（Fe3+）具有较长的电子自旋弛豫时间和较高的磁矩，被广泛用作T1‐MRI造影剂。因此，已设计出多种含锰或含铁纳米结构，通过释放Mn2+或Fe3+作为有前景的MR纳米探针，用于肿瘤微环境成像。[110–114]此类探针可在肿瘤内特定区域响应，从而为肿瘤的检测与治疗提供一定线索。

片冈及其同事报道了一种基于掺锰2+的磷酸钙（CaP）纳米颗粒并带有聚乙二醇（PEG）涂层的优异pH敏感型MRI纳米探针。[115]通过EPR效应在肿瘤区域聚集后，CaP基质将在酸性肿瘤微环境中溶解并释放出Mn2+离子，由于Mn2+与周围生物分子的相互作用，从而选择性增强肿瘤区域的T1‐MR信号。凭借pH响应特性，此类掺锰2+的CaP纳米颗粒可逐步识别缺氧肿瘤微环境，用于评估肿瘤恶性程度。

pH可激活纳米探针结构示意图)
pH可激活纳米探针结构示意图)

通过显著增强的磁共振信号进一步检测小型转移性肿瘤（图7）。这种快速且无创的缺氧检测对于监测肿瘤预后和转移具有重要意义，未来一段时间内可应用于临床诊断中癌症分级和分期的识别。

最近，黄等人采用共沉淀策略制备了基于锰铁层状双氢氧化物的纳米材料，其中Mn(NO3)2 和Fe(NO3)3 作为前驱体。这类血小板状纳米结构对酸性肿瘤微环境表现出高度敏感性，并可触发Mn2+和Fe3+的释放离子，从而显著增强实体瘤内的T1‐磁共振成像对比度。类似地，石及其同事团队设计了一种基于Mn2+离子的T1‐磁共振造影剂，将MnOx置于中空介孔二氧化硅纳米粒子内部，用于高效成像酸性肿瘤微环境。在弱酸性环境下，MnOx会溶解并释放Mn2+离子。在此情况下，探针的弛豫率r1可达8.81 mm−1 s−1，相较于中性条件有显著提升（提高11倍），并且几乎是商用Gd3+基造影剂的两倍。这类pH响应性磁共振探针能够灵敏地响应酸性微环境，并在肿瘤部位显著增强信号。

MnO2也已被开发用于智能探针，因其可在酸性肿瘤微环境中释放Mn(ΙΙ)离子而增强T1‐磁共振成像信号。马等人开发了一种对酸性H2O2响应的纳米平台SiO2–MB@MnO2，其具有含亚甲蓝(MB)的SiO2核心，MB作为光动力疗法(PDT)的光敏剂，以及用于屏蔽核心的MnO2壳层。为了选择性响应酸性病理微环境中过表达的H2O2，MnO2壳层可被H2O2,还原，不仅生成O2以克服缺氧状态，同时还释放出显著提升T1‐磁共振成像性能用于肿瘤成像与检测的Mn(ΙΙ)离子。因此，该探针有望共定位H2O2过表达和酸性区域，并用于癌症治疗。刘等人设计了用于癌症成像与癌症诊疗的多刺激响应纳米平台。该平台基于牛血清白蛋白稳定的MnO2纳米颗粒，修饰有顺铂前药和铪(Hf)离子。该前药可在谷胱甘肽存在下通过氧化还原过程发生裂解，从而释放顺铂用于化疗。同时，MnO2在H2O2存在下可生成O2，并在酸性条件下降解为Mn(ΙΙ)离子。Hf离子可作为放射增敏剂。因此，该探针可响应肿瘤微环境中的多种刺激，包括氧化还原、低pH和H2O2，实现成像与治疗。

3.2. 表面屏蔽式磁共振纳米探针

纳米环境界面是指纳米颗粒与周围环境中分子之间的界面。纳米颗粒作为造影剂的基本原理是通过改变其周围水质子的横向弛豫时间，因此可以通过调节纳米颗粒与周围水分子之间的相互作用来构建微环境敏感型磁共振造影剂。[57,119]基于此，在纳米颗粒表面包覆壳层，该壳层在正常情况下可屏蔽纳米颗粒与水分子的接触，但在肿瘤微环境中溶解，从而暴露纳米颗粒（NP）表面，进而在肿瘤部位实现磁共振信号增强，这是一种设计表面屏蔽‐响应性MRI纳米探针的可行思路。

已开发出多种通过将Fe3O4纳米颗粒封装于酸降解聚合物胶束中构建的pH敏感型MRI纳米探针，作为智能造影剂，可在肿瘤微环境中快速响应酸性条件以实现磁共振成像。该聚合物胶束由PEG和一种pH敏感的聚(β‐氨基酯)组成，在生理pH条件下可自组装，使Fe3O4纳米颗粒（NP）处于水分子与纳米颗粒之间的隔离状态，从而限制其T2对比度能力。然而，在肿瘤部位，pH响应组分中可电离的叔氨基基团可发生质子化使其可溶并将Fe3O4纳米颗粒（NP）暴露于水分子，从而显著增强磁共振T2成像对比度。

最近，范等人通过包封光敏剂氯素e6（Ce6）和钆配合物，制备了一种酸度敏感的荧光/磁共振双模态探针（S‐NP），用于成像引导治疗。该S‐NP具有独特的三层纳米结构，其中间层可在弱酸性微环境中因酰胺键断裂而被拆解。结果，S‐NP的聚乙二醇壳将脱落，使得水分子更容易接近纳米颗粒周围钆配合物的开放配位点，从而增强磁共振信号强度。[122]

通常，通过在肿瘤微环境中去除表面聚合物层，以诱导纳米颗粒与周围水质子之间更频繁的相互作用，是设计响应性MRI纳米探针的一种实用方法。但更有意义的是，一些抗肿瘤药物可被嵌入聚合物层中，并在分解过程中释放。因此，磁共振成像不仅可以选择性地揭示肿瘤微环境的变化，还能监测药物释放过程。

3.3. 聚集诱导增强型MRI纳米探针

纳米试剂的聚集也是一种可行的策略，用于增强MRI信号强度或在肿瘤特定区域内实现T1与T2对比度之间的转换。氧化铁纳米颗粒（IONPs）的MRI相对性与其直径密切相关。具有极小尺寸（<5 nm）且处于高度分散状态的IONPs可产生高的T1加权MRI信号。这些纳米颗粒表面的Fe离子可显著影响周围水质子的纵向和横向弛豫时间。然而，当极小尺寸的IONPs聚集组装后，T2弛豫会逐渐加快，从而导致T2对比信号显著增强。因此，IONPs可作为有效的开关/转换型MRI对比剂。受此特性的启发，王等人制备了具有优良癌组织渗透性的3.5 nm超细氧化铁纳米颗粒（uIONP）。此类uIONPs可在酸性肿瘤微环境中聚集并形成簇，不仅阻止纳米颗粒回流至血液或淋巴管，还可实现T1到T2对比的转换。[123]

此外，纳米颗粒（NP）的聚集也可导致T1对比度效应的增强。李及其同事开发了一种表面携带钆螯合的金纳米颗粒。[124]酸性肿瘤微环境触发纳米颗粒（NP）的组装，同时激活磁共振信号增强。具体而言，该纳米探针在pH 6.5条件下孵育8小时后的r1值可达5.6 mm−1 s−1，显著高于pH 7.4条件下的5.1 mm−1 s−1。

除了酸性pH外，酶消化是另一种可用作聚集激活开关的方法。在肿瘤微环境中，多种蛋白酶或蛋白水解酶在细胞外基质中高表达。因此，通过在纳米颗粒表面修饰相应酶的底物，利用底物的切割来控制其在肿瘤区域内的行为，可能是一种构建微环境响应系统的方法。因此，Gallo等人合成了两组离子纳米颗粒（IONPs），这些颗粒修饰了MMP酶的底物。在微环境中这些底物被切割后，任一组纳米颗粒（NP）上的叠氮基团或炔烃基团会暴露出来，并彼此之间选择性地发生生物正交反应，从而形成具有T2信号增强特性的自组装超顺磁性纳米簇网络。[125]

类似地，陈及其同事制备了具有小型磁性核和良好穿透能力的透明质酸（HA）包覆氧化铁纳米颗粒（Fe3O4@HA），以获得肿瘤清晰的T1加权磁共振成像图像。在酸性肿瘤环境中响应透明质酸酶（HAase），探针表面的透明质酸（HA）会被降解，初级氧化铁核心发生聚集，从而削弱T1并增强T2信号，实现肿瘤内部从T1到T2信号的转变。因此，可在实体瘤的不同时间点和不同位置获取T1‐和T2‐加权磁共振成像图像，有助于相关诊断。[126]

蛋白质或酶触发的MRI纳米探针也已被开发。梁及其同事报道了一种酶敏感缩合反应，可在肿瘤凋亡细胞中自组装Fe3O4@1纳米颗粒（NP），从而显著增强T2 MRI（图8）。

caspase 3/7敏感型磁共振成像纳米探针的示意图)

Caspase‐3/7是早期凋亡的重要生物标志物之一，可指导Fe3O4@1 NPs的聚集（r2= 185 mm−1 s−1），与对照组（r2= 112 mm−1 s−1）相比，导致r2值增加≈65%。更重要的是，体外和体内MRI实验均表明，Fe3O4@1 NPs在凋亡情况下提供了特异性的T2‐增强对比度，而对照组Fe3O4@1‐Scr NPs则未显示磁共振信号增强。在注射Fe3O4@1 NPs后，阿霉素（DOX）处理小鼠的T2‐加权冠状面MRI显示，该探针为评估治疗效率提供了一种可行的MRI策略，并有助于近期评估促凋亡抗肿瘤药物的疗效。

与肿瘤区域pH值变化范围较窄相比，不同瘤内区域酶的表达差异较大。因此，酶诱导聚集探针具有更好的特异性，能够更准确地显示肿瘤内部状态。

包括谷胱甘肽（GSH）、H2O2, O2•、 •OH等在内的氧化还原物质也可作为响应性探针聚集的触发器。李等人设计了一种可激活纳米探针，用于肿瘤细胞识别，该探针通过含有二硫键的胱胺将T2造影剂（Fe3O4 NP）与T1造影剂（Gd2O3 NP）连接。纳米复合物的形成会导致Gd2O3 NP与Fe3O4 NP之间距离过近，从而淬灭T1信号。在富含GSH的肿瘤微环境中，由于二硫键被切断，该纳米复合物的T1信号得以恢复。[127]在此策略中，通过调节顺磁性增强剂与超顺磁性淬灭剂之间的距离，可实现T1‐磁共振成像信号的开关转换，这种机制被称为距离依赖性磁共振调控（MRET），将成为设计微环境响应型磁共振成像纳米探针的一种有前景的方法。[128]

最近，高等人报道了一种肿瘤微环境响应型纳米探针，该探针可通过Fe3O4纳米颗粒的原位交联来增强肿瘤磁共振成像。当纳米颗粒表面的二硫键被肿瘤微环境中的谷胱甘肽裂解后，暴露出的巯基可与剩余的马来酰亚胺基团发生反应，从而导致颗粒聚集，并显著提高磁共振成像对比度增强性能，如图9所示。在裸鼠中的磁共振成像结果显示，由于探针具有聚集能力，在静脉注射8小时后，肿瘤部位的T2值达到≈50%，而对照探针仅引起约18%的下降。值得注意的是，由于探针表面存在自肽，T2值在注射后96小时缓慢恢复，T2值仍保持在约20%，该特性具有实现体内长期时序演化的磁共振成像的巨大潜力，可用于监测特定治疗周期内肿瘤区域的微环境变化。

99mTc标记的Fe3O4 纳米颗粒（NP）示意图及其在肿瘤微环境中由谷胱甘肽（GSH）触发的聚集)

4. 可激活光声成像纳米探针

光声成像是一种基于光声效应的成像技术，结合了光学和超声成像技术。光声效应最早于1880年被报道，但直到高强度光源和高灵敏度传感器相继出现后，光声成像才得以发展。1938年，Veingerov报道了光声效应的一项应用，用于检测N2气体中低浓度的CO2，开启了光声成像的进一步应用。在过去的二十年中，得益于激光领域和生物医学领域的重大进展，光声成像已发展成为可在解剖甚至分子水平上实现医学可视化诊断的技术。[69,70,129]为了实现超灵敏的体内光声成像，基于有机发色团或无机纳米粒子的各种探针已被用于制备光声对比剂，因其具有优异的近红外吸收性能。近年来，还报道了多种pH、酶和氧化还原可激活的光声成像纳米探针。

构建pH敏感型光声成像纳米探针的策略基于一对染料之间的光声信号比率，其中一种染料具有pH依赖性的光学吸收，另一种则具有pH非依赖性的光学吸收。陈等人报道一种用于活体成像的比率式光声pH敏感近红外纳米探针，如图10所示。[72]苯并[α]吩恶嗪（BPOx）和IR825作为一对染料，这两种染料可诱导人血清白蛋白（HSA）自组装并嵌入HSA纳米颗粒中。在这对染料中，IR825的光学性质不受pH影响，而BPOx在比率式光声和荧光成像下均表现出pH依赖性转变。因此，两种染料的光声信号比和荧光信号比均可用于测量酸性肿瘤微环境中的pH值。在通过两种成像模式对不同组织深度下的样本评估纳米探针的pH检测后，研究人员发现，光声信号的比率值随着组织深度的增加几乎保持不变，即使在10 mm的组织下仍可检测到信号。相反，探针在两个波长处的荧光信号仅在薄层组织（1.5 mm）下就迅速衰减。在此研究中，比较与传统的荧光成像方式相比，光声成像提供了具有更高空间分辨率和增强穿透深度的体内肿瘤微环境pH成像。并且，小鼠的解剖图像证明了其在肿瘤微环境三维图像中的潜在应用。

pH响应性荧光/光声双模态纳米探针的结构示意图)

佩特也可用于构建pH敏感型光声探针。苗等人报道了一种基于半导体寡聚物（SO）的pH可激活比率式光声成像探针纳米颗粒。[130]该纳米探针通过使用两亲性三嵌段共聚物SO和硼二吡咯甲烷（pH‐BDP）的纳米沉淀法合成。pH‐BDP与SO之间发生佩特（PeT）效应，导致SO的荧光沉默以及纳米颗粒的光声信号增强。SO在680 nm处具有pH无关的吸收峰，而pH‐BDP在750 nm处具有pH敏感的吸收峰。活体成像表明，可在肿瘤部位清晰检测到光声信号2厘米深度，显示出增强的穿透深度。通过向荷瘤小鼠注射探针后，利用比值型光声信号（PA680/PA750）在体内指示肿瘤微环境的pH值。

材料的可逆聚集不仅被用于构建pH敏感纳米颗粒，还开发出在中性条件下于正常组织中快速代谢，而在酸性肿瘤微环境中得以保留的纳米探针。曾等人报道了一种基于Fe(III)–没食子酸纳米颗粒的新型pH敏感光声成像剂。[71]这种可激活光声成像纳米探针在酸性条件（pH 5.0）下保持稳定，但在中性环境（pH 7.0）中逐渐溶解。体内实验证明，在注射后24小时，包括肝脏和脾脏在内的正常器官中的光声信号降低至背景水平，表明探针在这些器官中快速代谢。相反，由于这些探针在酸性肿瘤微环境中具有高稳定性，其在肿瘤微环境中的光声信号在注射后24小时仍可清晰检测到。

尽管已开发出许多pH敏感的光声成像探针，但在不同组织中的背景吸收干扰必须加以考虑，以准确测量体内的微环境pH。考虑到氧合血红蛋白（HbO2）和脱氧血红蛋白（Hb），Jo等人开发了一种可激活光声成像对比剂，用于体内的定量pH映射。[131]这些pH敏感纳米探针通过将光学pH指示剂（5‐(和‐6)‐羧酸）封装到聚丙烯酰胺纳米颗粒（PAA NPs）中制备而成。该指示剂在565 nm处的吸收表现为pH无关点，而600 nm点则与不同pH密切相关。此外，还测量了576和584 nm点，以校正考虑到HbO2和Hb光学吸收的组织背景影响。通过四波长光声信号测量可实现体内准确的定量pH映射，在组织中6 mm深度处的误差小于0.16 pH。

对于酶敏感型光声成像，特定酶对肽的裂解是一种典型方法，已应用于其他传统检测技术，包括荧光成像和磁共振成像。为了构建酶敏感型光声成像对比剂，将两种发色团BHQ3和Aleca750通过可被MMP‐2裂解的Geeee[Ahx]PLGLAGrrrrrK连接。在完整状态下，这两种发色团在675 nm和750 nm处显示出强度相似的两个光声信号。在MMP‐2丰富的微环境中，肽连接子的裂解导致仅BHQ3的光声信号（其在肿瘤细胞中积累）可见，而另一种染料则会扩散离开。因此，两个波长处光声信号强度的差值表明MMP‐2高活性。基于类似的酶敏感裂解机制，艾等人描述了一种通过酶诱导上转换纳米颗粒交联实现肿瘤定位的策略。Nd3+‐掺杂的UCNPs经聚丙烯酸（PAA）和聚乙烯亚胺（PEI）修饰后，进一步连接Ce6和一种酶敏感肽。当在肿瘤微环境中通常上调的组织蛋白酶B（Cts B）裂解该肽后，暴露的半胱氨酸与2‐氰基苯并噻唑相互反应，诱导UCNPs之间的共价交联。这种对酶敏感的UCNPs交联导致上转换发光增强、光声信号减弱以及活性单线态氧生成增加。

结论与展望

在这篇综述中，总结了近年来用于肿瘤相关微环境检测的可激活分子成像纳米探针在光学成像、磁共振成像和光声成像方面的最新进展。与小分子可激活成像探针相比，由于纳米探针具有较大的比表面积，可为修饰功能基团提供充足空间，因此被视为设计响应不同刺激（如酸性条件、特定酶、氧化还原等）的响应机制的有前景的平台。尽管该领域已取得丰硕成果，但在开发用于体内肿瘤微环境成像的可激活纳米探针方面仍面临巨大挑战。例如，由于肿瘤的发展与微环境中的多种生理因素密切相关，设计多敏感机制对于基础研究和临床应用具有重要意义。此外，研究人员仍需付出巨大努力，以发现与理解肿瘤机制相关的生物标志物，并探索其可激活策略。最后，已有少数研究展示了响应性成像纳米探针在临床中的潜在应用，包括影像引导手术、药物控释、评估治疗效果以及光热治疗。然而，仍需持续努力，围绕如何将抗癌药物装载到纳米探针上，构建刺激响应型智能诊断与诊疗一体化纳米平台开展研究。